导读
选择优良的提取工艺
荷叶属睡莲科植物莲的荷叶叶片,是总黄国家卫生部公布的既是食品又是药品的植物。荷叶中富含多种具有生物活性的酮提成分,如荷叶精油、取工其抗荷叶生物碱、艺及氧化荷叶多糖及荷叶黄酮等,性研其中荷叶黄酮是荷叶其主要活性物质。报道显示,总黄黄酮类化合物对治疗血管病有很好的酮提效果,具有抗氧化、取工其抗稳固血管、艺及氧化疏通血管、性研防止高龄人的荷叶血压疾病等功效,对身体代谢和人体免疫也有重要作用。总黄所以,酮提针对影响荷叶总黄酮提取的因素进行研究,选择优良的提取工艺,提高荷叶总黄酮的提取率,研究其总黄酮抗氧化性,对人体健康保护具有重要意义。
荷叶样品,河北衡水湖;无水乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、硫酸亚铁、H2O2、水杨酸,均为分析纯;芦丁对照品,含量98.7%,化学标准品,上海金穗生物科技有限公司。722型可见分光光度计,上海仪电分析仪器有限公司;FA2004B型电子天平,上海衡平仪器仪表厂;FW100型高速万能粉碎机,天津市泰斯特仪器有限公司;80-2型高速离心机,金坛市国旺实验仪器厂;BL6-180A型超声波清洗机,上海碧浪仪器有限公司;SHB-Ⅲ型循环水式真空泵,郑州长盛实验仪器有限公司;GZH-DH-X型电热恒温干燥箱,郑州宏朗仪器设备有限公司。
将风干的荷叶置于干燥的粉碎机,粉碎4min后,过60目分样筛,得到所需荷叶样品,储存于密封容器中,待用。
荷叶中总黄酮的提取流程:预处理后的荷叶粉→加入乙醇→超声提取→冷却至室温→离心→收集上清液→测吸光度→计算黄酮含量。
准备75%乙醇溶液,电子天平称量1.00g处理备用的荷叶粉末,依据料液比1∶6,1∶8,1∶10,1∶12,1∶14分别混合,实验时间25min,温度45℃,进行总黄酮提取。然后将得到的提取液离心分离15min(转速5000r/min),合并清液,用75%乙醇定容至25mL,取1mL清液进行黄酮含量测定。
准备75%乙醇溶液,用电子天平称量1.00g处理备用的荷叶粉末,依据料液比1∶10混合,实验时间为25min,分别在温度为25℃、35℃、45℃、55℃和65℃的实验条件下提取总黄酮。然后将得到的提取液离心分离15min(转速为5000r/min),合并清液,用75%乙醇定容至25mL,取1.00mL清液进行黄酮含量测定。
用电子天平称量1.00g处理备用的荷叶粉末,依据料液比1∶10,加入不同浓度(45%、55%、65%、75%、85%)的乙醇,实验时间为25min,温度45℃,进行总黄酮提取。然后将得到提取液离心分离15min(转速为5000r/min),合并清液,用75%乙醇定容至25mL,取1.00mL清液进行黄酮含量测定。
准备75%乙醇溶液,用电子天平称量1.00g处理备用的荷叶粉末,依据料液比1∶10混合,超声温度45℃,超声提取时间分别为15min、30min、45min、60min、75min。然后将得到提取液离心分离15min(转速为5000r/min),合并清液,用75%乙醇定容至25mL,取1.00mL清液进行黄酮含量测定。
综合以上的单因素实验再次进行正交实验,以确定提取荷叶总黄酮的最佳实验方案。正交因素水平表见表1。
将10mg芦丁溶于75%乙醇中,小幅度地摇晃,静置后使用蒸馏水定容至10mL,得到浓度为1mg/mL的芦丁标准品溶液。取0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL、1.20mL芦丁溶液放入20mL比色管中,量取1.0mL浓度为5%NaNO2溶液,加入试管,摇匀后静置8min;量取1.0mL浓度为10%的Al(NO3)3溶液,加入比色管,轻晃后放置8min;量取10.0mL浓度为5%的氢氧化钠溶液,加入比色管;向比色管中加入75%的乙醇至20mL,轻晃,静置18min。510nm处测定各溶液的吸光度,做出芦丁标准曲线。
准确量1.2所得的清液1.0mL,按以上步骤在510nm的位置检测其吸光度值。依照标准曲线,求出对应的黄酮浓度,依照公式计算黄酮含量。
黄酮含量(g/100g)=a×c×V/10W
(c,V,W为实验原始数据)
式中:a-稀释倍数;c-黄酮浓度,mg/mL;V-提取液总体积,mL;W-甘草粉质量,g。
用95%乙醇溶液对0.0112g的DPPH进行溶解;将上述溶液加入到50mL容量瓶中,加入95%乙醇溶液定容。
取配好的DPPH溶液2.00mL于试管中;移取2.00mL的蒸馏水加入比色管,定容,轻晃,阴暗处静置18min;测定溶液在510nm位置的吸光值Ac。测试3次,取均值。
将不同浓度的样品溶液2.00mL用移液管移至试管中;取配好的DPPH溶液2.00mL,加入比色管,定容,轻晃,背光处放置18min;测定510nm处的吸光值Ai。重复进行3次,取平均值。
分别将不同浓度的样品溶液用移液管移取2.0mL至不同试管中;量取2.0mL蒸馏水放入比色管,定容,轻晃,阴暗处放置18min;测定510nm处的吸光值Aj。重复进行3次,取平均值。相同步骤测定相同浓度VC标准液的清除能力为对照。
(5)计算DPPH·清除率:
(1)量取2.00mL蒸馏水放入比色管。
(2)量取2.00mL浓度为6mmol/L的FeSO4溶液,加入比色管后摇匀,放置15min。
(3)量取2.00mL浓度为6mmol/L的水杨酸,加入比色管后摇匀,放置15min。
(4)量取2.00mLH2O2溶液,加入比色管摇匀,放置15min。
(5)测出溶液在510nm下的吸光度值,记为D。
量取2.00mL蒸馏水放入比色管,测定将荷叶黄酮提取液加入到羟自由基后溶液的吸光值Di,量取2.00mL浓度为6mmol/L的FeSO4溶液,加入比色管后摇匀,放置15min,量取2.00mL浓度为6mmol/L的水杨酸,加入比色管后摇匀,放置15min,量取2.00mLH2O2溶液,加入比色管摇匀,放置15min,测出溶液在510nm下的吸光度值,记为D。
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相关链接:水杨酸,黄酮,荷叶,氢氧化钠
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